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A549/DDP细胞株构建的处理步骤详解

点击次数:212 发布时间:2018-12-20
  A549/DDP细胞株构建原理:
  A549/DDP细胞株转染,就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可
  长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒,根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代,从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。
  A549/DDP细胞株应用:
  A549/DDP细胞株观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能(稳定,可长期进行研究)
  悬浮生长细胞的传代:
  直接直接吸去或离心后吸去培养上清液,用新鲜培养液悬浮细胞,1:3或1:5稀释细胞后,分瓶继续培养。
  帖壁生长细胞的传代:
  吸去培养液,用PBS洗涤细胞一次,加入消化液,在37℃中消化约3——10分钟,待细胞开始脱落时,倒去消化液,加入新鲜培养液,悬浮和吹打分散细胞。也可以待细胞完全消化脱落,500×g离心5分钟,去除消化液,用新鲜培养液悬浮细胞。1:3或1:5稀释细胞后,分瓶继续培养。
  A549/DDP细胞株的冻存:
  1.取培养2——3天生长旺盛的细胞,用细胞培养液将细胞配成2×106——2×107/ml。
  2.在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液,0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜(或甘油),混匀后密封。置4℃1小时,——20℃2小时,然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。
  3)A549/DDP细胞株的复苏:
  复苏时,从液氮中取出冻存管,立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含15%小牛血清的RPMI-1640培养液中,置37℃5%CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液,更换新鲜的上述培养液,继续培养;帖壁细胞则培养2——3小时,待细胞帖壁后,倒去培养液,更换新鲜的上述培养液,继续培养。也可以在加入新鲜培养液以后,500×g离心5分钟,去上清液,加入新鲜培养液,继续培养。
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