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浅析构建A549/DDP细胞株的两大技术要点

点击次数:169 发布时间:2019-03-22
  A549/DDP细胞株作为科研工作者常用的工具,主要用于生物医学研究的体外实验(Invitro)研究。截止目前,被ATCC及DSMZ数据库收录的商用细胞株约为4000种左右。近年来,随着细胞株的广泛应用,细胞株被错误鉴定和交叉污染问题显得尤为突出。为了确保实验结果的可重复性,NIH和ATCC近期对此发出呼吁,要求研究者对细胞株进行鉴定,已明确所使用细胞的身份。多种主流杂志也纷纷要求作者在投稿时提交细胞株鉴定(CellLineAuthentication)报告,有些杂志甚至要求作者提供实验前、实验中和实验后等不同阶段的细胞株鉴定报告。下面我们介绍下稳定细胞株和不稳定细胞株的区别
  什么时候需要稳定A549/DDP细胞株?
  以下实验,构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求:
  1),外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率,但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞,可以使用腺相关病毒载体转导外源基因,因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。
  2),需要构建使用诱导表达系统,这主要是由于:a),过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素;b),目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
  3),希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数,以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。
  4),部分细胞种类,病毒载体亦无法达到高转导效率,通过构建稳定株,达到外源片段的高效表达。
  5),长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能,通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也极大方便实验研究。
  6),部分蛋白稳定性极强,瞬时RNA干扰因为作用周期短,只能抑制目的基因的表达,但无法去除已经表达的目的蛋白,所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。
  7),需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株,以防止注射入动物体内后,很快外源片段表达丢失。
  8),细胞个体差异(同一类细胞,不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰,需要构建单克隆细胞株去除干扰。
  9),需要将外源片段插入基因组中,比如基因敲除,基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。
  什么时候不需要构建稳定株?
  以下实验不需要构建稳定A549/DDP细胞株
  1),希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。
  2),2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的,比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用,或者观察某些细胞周期抑制,凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。
  3),细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞,多为转化细胞系或者癌细胞,细胞个体差异大,瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。
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