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筛选是构建PATU8988/FU细胞株的首要步骤

点击次数:430 发布时间:2018-09-21
  动物细胞是生产治疗性重组蛋白的强有力工具。为与小分子药物区别开来,治疗性蛋白、疫苗以及细胞治疗产品统称为生物制品。宿主细胞的选择和改造对于提高产品的产量和质量来说至关重要。因此必须对细胞进行筛选,选出具有高表达量和良好生长特性的细胞。在此我们主要讨论适用于大规模生产重组蛋白的PATU8988/FU细胞株的筛选。
  工业上重组蛋白的制备主要有两种方式:瞬时转染和稳定转染。瞬时转染经常用于制备少量蛋白(多达克级)用于药物开发早期的蛋白活性或动物实验。瞬时转染并不产生克隆PATU8988/FU细胞株,它只是暂时将编码外源蛋白的质粒转导入已有的PATU8988/FU细胞株里面(比如HEK293或COS细胞)。随着细胞的分裂外源基因不断丢失,蛋白产量较低,一般在1-100mg/L。近年来有报道称HEK293细胞中瞬时表达产量可达1g/L。
  与瞬时转染不同,稳定PATU8988/FU细胞株是为工业化生产治疗性蛋白而构建的。稳定PATU8988/FU细胞株需要具备在不同的时间,不同的场地以及不同的批次间生产相同质量产品的能力。在选定生产用PATU8988/FU细胞株之后,需要建立主细胞库(mater cell bank)。从主细胞库复苏后,扩增建立工作细胞库(working cell bank),工作细胞库用于生产。细胞库通常保存在液氮中,需要维持整个产品的生命周期。在构建生产用PATU8988/FU细胞株的过程中,宿主细胞和表达载体至关重要。
  科研人员在蛋白组学和转录组学水平上研究了B细胞变成浆细胞所发生的生理变化。细胞转变提高了能量代谢水平,改善了蛋白分泌和糖基化能力,同时增加了氧化还原水平用来应对活性氧的影响。B细胞或浆细胞的基因组中只有一个功能性的免疫球蛋白基因。在B细胞成熟的过程中,二倍体细胞中其中一个等位基因发生失活。但是,仅仅是免疫球蛋白基因的一个拷贝足以使浆细胞成为一个高产的分泌细胞。因此,只需将目的基因的一个拷贝整合到杂交瘤细胞基因组适合的位置就可以使其成为分泌外源蛋白的强大细胞。与瘤细胞不同,CHO必须经过改造后才能提升蛋白表达能力。
  除了蛋白表达能力之外,的PATU8988/FU细胞株还应具备良好的生长和代谢特性。在过去的十多年里,大量转录组学和蛋白组学的研究致力于揭示高产PATU8988/FU细胞株的特性。人们逐渐意识到没有那一种主要的调控因素能使CHO或NS0来源的重组细胞变成高产PATU8988/FU细胞株。高产PATU8988/FU细胞株的形成涉及细胞内许多通路的改变,比如代谢、分泌、氧化还原平衡和生长/死亡调控;更可能的是大量基因表达水平的微小变化,而不是几个主要节点的大变化。
  首先,通过质粒将目的蛋白的编码基因导入到细胞内。质粒上除了目的基因外还带有抗性基因,比如抗生素抗性基因。这样在转染后就可以利用选择压力富集整合质粒的细胞。在哺乳动物细胞中质粒不能进行复制,未整合到基因组中的质粒随着细胞分裂逐渐丢失。在一段时间的选择压力后,所有存活下来的细胞基因组中都整合了外源质粒。
  获得了一系列整合了外源基因的稳定细胞后,接下来就需要从中筛选出表达量搞克隆。常用的方法是检测96孔细胞培养板中蛋白的浓度;另外一个方法是让细胞在软琼脂上生长形成集落,然后利用原位免疫沉淀技术获得高产细胞。近年来,发展起来的高通量自动化筛选技术也被受关注。
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